Food Control:​葡萄酒业副产物酚类化合物的化学组成、抗氧化及抗菌活性研究

葡萄酒业副产物酚类化合物的化学组成、抗氧化及抗菌活性研究

期刊：Food Control（6.652）

发表时间：2018.05

葡萄是世界上栽培最多的作物之一。酿酒过程中会产生约葡萄重量20%的废物。葡萄渣，包括葡萄皮、葡萄枝条和葡萄籽，通常被认为是潜在的环境问题，或是一种被低估的产品。从这个意义上说，葡萄不仅是一种营养来源，而且是几种具有抗菌、抗氧化和抗炎功效的化合物的来源。次生代谢物在不同植物谱系的进化中具有重要的作用。酿酒厂的副产品，即葡萄渣，是这些活性化合物的丰富来源。

目前，葡萄酒生产对几个国家的经济做出了重大贡献，60%的葡萄酒总产量是由欧盟国家生产的。其中，葡萄牙是欧盟第五大葡萄酒生产国，2014年的产量超过60万吨。酿酒厂的副产品，如果皮、种子和枝条，在生产的葡萄酒中占25-35 kg/hL ，是一种合适且廉价的具有潜在抗菌活性的化合物来源，本研究的主要目的是评价葡萄果皮、果籽和枝条等不同成分的酚类化合物组成，并评价其对几种耐药细菌的抗菌活性。

1 植物材料

使用的植物材料包括Touriga Nacional和Preto Martinho两种葡萄牙红葡萄品种的枝条、种子和果皮。

2 多酚的提取

3 总酚和花青素含量的测定

4 单宁含量的测定

5 HPLC-DAD分析

6 抗氧化活性的测定

7 菌株、培养基和生长条件

对8种耐药细菌进行了药敏试验：粪肠球菌Enterococcus faecalis（E. faecalis）vanB2-C3735，屎肠球菌Enterococcus faecium（E. faecium）vanA-C2302，大肠埃希菌Escherichia coli（E. coli）C999（CTX-M-15），肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae（K. pneumoniae）C1370（CTX-M-15），铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa（P. aeruginosa）C4660（VIM- 2），金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus（S. aureus）C5932（MRSA CC398），表皮葡萄球菌Staphylococcu epidermidis（S. epidermidis）C3658（linezo-R）和肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis（S. enteritidis）C4220。食源性单核增生李斯特菌（L. monocytogenes）ATCC700302和蜡样芽孢杆菌（B. cereus）ATCC1306。

1.酚醛剖面分析

葡萄牙波特酒是由生长在杜罗地区的葡萄品种酿造的。都是杜罗地区种植的杜丽嘉和普雷托玛尼诺品种，杜丽嘉广泛应用于波特酒的生产。据我们所知，这是关于葡萄牙品种Preto Martinho的酚类成分和抗氧化活性以及抗菌活性的首次报道。表1显示了两个品种的果皮、枝条和种子的总酚含量（TPC）、总花青素含量（TAC）和总单宁含量（TTC）。Preto Martinho皮提取物的TPC（360 μg/mg）、TAC（65.8 μg/mg）和TTC（86.7 μg/mg）浓度高于Touriga national（TPC：35.5 μg/mg；TAC：9.3 μg/mg；TTC：7.23 μg/mg）。这些结果是预料之中的，因为与Touriga Nacional相比，Preto Martinho葡萄是高度着色的。然而，葡萄的酚含量主要取决于葡萄的品种，而不仅仅是葡萄的颜色。两个品种种子的TPC在三种葡萄成分分析中最高，与其他研究一致。在枝条提取物的TPC和TTC方面，Preto Martinho的浓度再次高于Touriga national。两个葡萄牙品种在TPC上的显著差异表明，Preto Martinho是一个比Touriga Nacional更好的多酚来源。

采用HPLC-DAD对Touriga Nacional和Preto Martinho（PM）品种的皮、种子和枝条中酚类化合物进行了分析。通过保留时间、特征紫外/可见光谱、标准品和文献对化合物进行鉴定。定量用外部标准品的校准曲线进行，并以儿茶素当量表示。通过对两个品种的多酚谱分析，共发现了24种多酚，包括酚酸、黄烷-3-醇、黄酮醇、二苯乙烯和花青素。表2显示了在每个品种的表皮、种子和枝条中鉴定和量化的主要酚类化合物。两种葡萄果皮中多酚含量均以锦葵色素-3-O-葡萄糖苷含量最高，Preto Martinho提取液中锦葵色素-3-O-葡萄糖苷含量（464.9 μg/mg）高于Touriga Nacional提取液（178.8 μg/mg）。在Preto Martinho（117.3 μg/mg）和Touriga national（53.2 μg/mg）果皮提取物中，芍药色素-3-O-葡萄糖苷含量次之，其次是阿魏酸（PM：115.5 μg/mg；TN：51.1 μg/mg）和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（PM：98.1 μg/mg；TN：39.4 μg/mg）。最高浓度的化合物在两个葡萄品种之间是相似的，这可能是由于两个品种生长在同一地区，在相同的条件下。尽管如此，Preto Martinho果皮提取物在一般情况下比Touriga national有更高的酚类化合物浓度。在所有花青素中，两个品种的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的浓度最低，这可能是因为矢车菊素是其他花青素生物合成的前体。两品种黄酮醇组中含量最高的化合物为芦丁（quercetin-3-O-rutinoside），Touriga Nacional的含量（27.0 μg/mg）高于Preto Martinho（9.8 μg/mg）。种子提取物中发现的主要酚类化合物为儿茶素（Preto Martinho为17.2 μg/mg, Touriga national为7.7 μg/mg）和表儿茶素（Preto Martinho为15.5 μg/mg, Touriga national为11.2 μg/mg），与文献相当。两个品种表儿茶素的含量都高于儿茶素。这些变异可能是品种间遗传差异、光照强度、土壤成分、地区等因素的结果。Preto Martinho种子提取物中含量最高的化合物为反式白藜芦醇（15.4 μg/mg），Touriga Nacional中含量最高的化合物为没食子酸（6.7 μg/mg）。在葡萄枝条方面，只有少数研究调查了这类酒庄副产品的酚类成分。两个品种中儿茶素含量最高，Preto Martinho枝条中儿茶素含量为38.7 μg/mg，Touriga Nacional枝条中儿茶素含量为29.3 μg/mg。其次是芦丁（27.3 μg/mg）和阿魏酸（19.6 μg/mg）。葡萄枝条主要由木质素、单宁、纤维素和半纤维素组成。木质素由对香豆酸、阿瓦酸等酚酸组成。两个品种的枝条提取物中表儿茶素的浓度为15.5 μg/mg。

表1 Touriga Nacional和Preto Martinho品种的皮、种子和枝条的总酚含量（TPC）、总花青素含量（TAC）和总单宁含量（TTC）

a以表儿茶素当量微克/毫克残留量表示

表2 葡萄品种中多酚类化合物（μg/mg残留量）含量及保留时间

a未检测到

2.抗氧化活性

DPPH结果表明，Preto Martinho品种的抗氧化活性高于Touriga national。ABTS法检测结果显示，Touriga Nacional的总平均值分别为33.2、185.2和59.0，Preto Martinho的总平均值分别为80.6、206.3和97.9 μmol Trolox当量/g（表3）。DPPH法检测结果在有效浓度提供50%的抑制（EC50），与ABTS试验的结果很一致，因为种子提取物也发现了更高的抗氧化能力，其次是枝条和皮。

表3 Touriga Nacional和Preto Martinho品种表皮、种子和枝条的抗氧化活性

3.体外抗菌试验

葡萄不同部位的提取物具有不同的抑菌效果。总多酚含量与抑菌带直径成正比，表明这些化合物具有抗菌作用。与大多数研究不同的是，我们使用的抗生素耐药细菌有几种机制，使它们对抗生素和几种天然化合物产生抗性。两种酚类化合物对S. enteritidis，E. coli，P. aeruginosa均无抑制作用，K. pneumoniae是唯一对酚类化合物敏感的革兰氏阴性菌。事实上，多酚提取物对革兰氏阳性菌更有效。表皮葡萄球菌对多酚的敏感性最高，其次为单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌。

两品种的种子提取物均表现出较高的抑菌活性，10株菌株中有7株具有抑菌作用。尽管Preto Martinho种子提取物对E. faecium无抑制作用，但该品种种子提取物的抑菌活性仍高于Touriga Nacional。

Touriga Nacional皮提取物的抑菌效果优于同品种枝条提取物，而Preto Martinho提取物的抑菌效果则相反。对比两个品种，Preto Martinho皮提取物的MIC低于Touriga national。在试验浓度下，Touriga Nacional皮提取物对S. aureus和E. faecalis的生长均无抑制作用，Preto Martinho皮提取物对E. faecium, B. cereus和K. pneumoniae均无抑制作用。

枝条提取物对相同细菌的抑菌活性最低。Touriga Nacional枝条提取物对S. epidermidis, S. aureus, E. faecium和L. monocytogenes有抑制作用，而Preto Martinho枝条提取物对S. epidermidis, E. faecalis, E. faecium, L. monocytogenes和K. pneumoniae有作用。L. monocytogenes是一种经常与食源性疾病相关的致病菌，两种葡萄品种的枝条提取物对其均有抑制作用。

各提取物的抑菌活性可能是由于不同酚类化合物的存在，它们之间可能有协同作用。然而，每一种多酚的结构化学也可能对其抗菌活性起作用。

表4 两个葡萄牙葡萄品种的葡萄皮、枝条和种子提取物的最低抑菌浓度

酿酒厂的副产品是一个很好和廉价的多酚来源，与两个品种的调查显示出高含量的多酚。然而，Preto Martinho比Touriga national拥有更大的多酚，花青素和单宁含量。据我们所知，Preto Martinho品种的酚类成分是第一次被报道。在所研究的葡萄成分中，两个品种的葡萄籽总酚含量和单个酚含量都是最丰富的，抗氧化能力也是最高的，因此可以进一步作为膳食补充剂进行评价。种子提取物中儿茶素、表儿茶素和反式白藜芦醇含量较高，可能是其抗菌活性最强的原因。所有革兰氏阳性菌均表现出对酒庄副产品中提取的多酚的敏感性。革兰氏阴性菌中只有K. pneumoniae对种子提取物敏感。

天然化合物，如多酚，可作为抗菌剂，可能成为有用的治疗工具。然而，这些产品单独使用可能不能替代抗生素，而是在联合使用时增强抗生素的效果。提取物对食源性细菌也有效，这表明多酚可能有潜在的用途作为食品保鲜剂。果皮、种子和枝条提取物中含有大量不同的酚类化合物。因此，为了确定哪一种多酚具有抑制作用或更强的抑制作用，还需要对每一种分离的多酚对耐药菌的作用进行更多的研究。