【文献速递】红酒干预不改变血浆氧化三甲胺,但与血浆代谢物和肠道微生物群的广泛变化有关(2)

https://doi.org/10.1093/ajcn/nqac286

最初纳入57名患者，其中15名被排除在外。在排除的患者中，8名退出试验，2名使用抗生素，1名首次实验室检查患有高甘油三酯血症，1名确诊为白血病并转诊至血液科。1名患者在治疗过程中使用了二甲双胍，1名患者患有痛风性关节炎，1名患者在随机分组后不久发生了急性心肌梗死。

最终，42名男性患者完成了试验(有关患者的更多细节显示在补充图1的CONSORT流程图中)。患者的基线特征如表1所示。

所有患者都有冠状动脉造影或临床事件确诊的冠心病，并且临床病情稳定，年龄在46岁至69岁之间；他们的体重平均超重，BMI中位数为27.1，平均腰围为98.0cm。患者的血压、血脂和血糖都得到了很好的控制。所有志愿者对RW的耐受性都很好。根据患者的RW服用记录，没有遗漏的的情况，并且所有建议剂量均在3wk干预期内服用。在RW服用期间，与戒酒期间相比，血压、心率或BMI没有显著变化。

此外，对超敏C反应蛋白、IL-6、脂多糖、血糖或肾小球滤过率也没有显著影响。然而，服用RW后，高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和总胆固醇浓度增加。此外，尽管观察到凝血酶原时间(P=0.004)和血小板计数(P=0.02)减少(补充表1和2)，但肝酶浓度没有变化。

（表1）

患者在5次院内回访时接受了营养评估，并在每个干预期（禁食或RW）结束时完成3天的饮食回顾。

根据两次饮食回顾的结果，患者都遵循了膳食指导并保持了相同的食物摄入模式。除了在RW干预期加入酒精及其热量外，2个干预期的其他常量营养素或微量营养素消耗没有显著差异（表2）。

（表2）

此外，营养师审查了所有患者的饮食记录，并确认根据我们的膳食指南，自我报告中没有摄入禁用的研究食品：在洗脱和干预期间，富含多酚的食品、益生元、益生菌和发酵产品。

营养师审查了RW饮用的书面召回记录，并确认在戒酒期间没有服用酒精饮料，在RW干预期间没有服用其他饮料(提供的RW除外)。

最后，在补充结果中可以找到饮食记录中描述的营养素与肠道微生物群改变的相关性。

在2wk洗脱期后，与戒酒期相比，服用RW后观察到的肠道微生物群特征得到了改善。β多样性显示不同组之间有明显的分离(图2A)，肠道微生物群可区分是否服用RW。

相比之下，α多样性在RW饮用后没有变化(补充图3)。在RW饮用后，拟杆菌、颤螺菌、罗氏菌和普氏菌为主。在RW时期，副沙门氏菌是区分肠道微生物群组成的最突出的属(图2B)。三份来自3个不同患者的粪便样本，排除读数较低、每个样本<10个读数的患者在分析之外。

此外，我们调查了肠道微生物群与临床、生化和营养变量的相关性，如补充图4所示。对这些发现的描述可以在补充结果中找到。

（图2）

服用RW后的血浆TMAO浓度与洗脱期后的TMAO浓度没有显著性差异(表3)，也没有证据表明存在延滞效应，因为表3显示在洗脱期的开始和RW期的开始之间没有明显差异。

此外，在洗脱期开始和结束时收集的样品中，TMAO浓度变化很大：这2组样品之间的ICC为0.049（95%CI：0.255，0.345；P = 0.377）。

（表3）

在10名受试者中，在3种不同的样本技术(补充表3)之间观察到了高度的一致性，其ICC为0.915(95%CI：0.861，0.951；P<0.001)。速冻和冷藏的一致性最高(ICC为0.993)(补充表4)。

相反，TMAO的重复测量之间的一致性很低(表4)，这表明同一个体随着时间的推移具有显著的测量间变异性。

（表4）

血浆TMAO与肾功能呈负相关，相关性较弱(补充结果)。在营养摄入量方面(补充表5)，血浆总抗氧化与蛋白质摄入量(ρ：0.478，P=0.025)和胆固醇摄入量(ρ：0.336，P=0.045)呈正相关。

没有显著证据表明血管紧张素转换酶抑制剂或利尿剂的使用、TMAO浓度和RW干预之间存在关联(补充表6)。

关于TMAO与肠道微生物群的关系，在戒酒期间，TMAO与罗氏菌呈弱相关，与毛螺菌呈负相关。服用RW后，TMAO血浆浓度与拟杆菌呈正相关(补充图5C)。

在非靶向血浆代谢组学中，39种代谢物在RW干预后发生了显著变化(图3B)，如补充表7所列(补充表8没有延滞效应的迹象)。

有显著变化的代谢物可能代表氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素和辅因子途径的变化(图3A)。通过非参数数据的配对Wilcoxon符号等级检验和参数数据的配对t检验，确定服用RW后与戒酒期间相比发生显著变化的代谢物。

（图3）

磷酸戊糖途径(PPP)、葡萄糖醛酸/抗坏血酸盐途径和芳香族氨基酸代谢表现出几次相互转化(图3C)。

在这些途径中，几种代谢物的浓度增加。服用RW后，PPP非氧化分支的组成成分--景天庚酮糖、阿拉伯糖、核糖醇、阿拉伯糖醇和木糖醇的浓度显著增加。核糖醇是PPP中的重要代谢物，也是核黄素(维生素B2)的组成部分，核糖醇浓度的增加可能表明核黄素代谢途径的调节。在葡萄糖醛酸/抗坏血酸盐途径中，古洛酸盐的浓度显著增加，古洛酸是抗坏血酸生成的必备中间体。

此外，芳香族氨基酸的微生物群相关产物(即色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)也发生了变化。服用RW后，色氨酸的微生物衍生代谢物3-吲哚丙酸(IPA)的浓度显著增加。酪氨酸代谢产物龙胆酸和高香草酸的浓度也增加，而甲状腺激素的浓度下降。RW的服用也增加了苯丙氨酸代谢产生的1-羧乙基苯丙氨酸的浓度。

服用RW后，谷氨酸代谢产物柠苹酸和N-乙酰-L-谷氨酰胺的浓度升高。

支链氨基酸代谢物3-甲基-2-氧代戊酸和2,3-二羟基苯甲醛的浓度也增加。此外，服用RW后，半胱氨酸代谢物Lanthionine和多胺代谢物acisoga的浓度也有所增加。

服用RW后，脂肪代谢物，包括雄性激素、内源性大麻素和脂肪酸，发生了改变，与戒酒相比，服用RW后，雄激素5α雄激素-3-β、17-β-二醇单硫酸盐、雄激素单硫酸盐C19H28O6S∗和雄烯二醇(3β，17β)单硫酸盐浓度增加。

此外，我们检测到内源性大麻代谢物亚油酰乙醇胺及其中间体亚油酰亚麻酰甘油(18：2/18：3)[2]∗的浓度随着RW的消耗而降低。

此外，服用 RW后，脂肪酸代谢物的浓度发生了改变，表现为3-癸烯酰肉碱浓度的下降，2R，3R-二羟基丁酸酯和3-羟基硬脂酸浓度的增加。

服用RW后，血中赤藓糖醇和乙基α-吡喃葡萄糖苷的浓度较戒断后显著升高。

此外，黄嘌呤途径中氨茶碱的代谢物1，3-二甲基尿酸的浓度增加。

对于随机选择的20名患者，我们使用Diablo平台的多重组学集成数据来同时识别相关和区分微生物群和血浆代谢组学特征，这些特征能够在患者队列中区分RW和酒精戒断干预。

微生物组数据集包括586个分类群，而代谢组数据集由39种代谢物组成。每个数据集的第一个成分高度相关，表明每个成分对区分不同的RW组和戒酒组具有很高的区分力，相关指数为0.85。补充图5显示了第一个组分中的代谢物和分类群。

最佳选择的关键预测因子包括肠道微生物群的几个分类群(即链球菌、布劳特氏菌、瘤胃球菌、拟杆菌、普氏菌)以及氨基酸途径、脂肪途径和辅因子途径中的代谢物，如泛酸。所有数据集之间的一致性显示在箭头图中（图4A），这表明2个全息图（微生物群和代谢组学）数据集可以区分2种情况。

在不同的干预措施中，分类群和代谢物是不同的，关键预测因子之间的强相关性也促成了RW组和戒酒组之间的显著分离（图4B）。

（图4）

这项研究表明，在年龄在46岁到69岁之间(中位数BMI为27.1)、冠心病稳定的男性患者中，短期、适度服用RW并不会降低TMAO浓度。

同时，肠道微生物群在服用RW后发生改变，以及血浆代谢组，特别是影响氨基酸、维生素和辅因子、脂类和碳水化合物的途径。此外，血浆TMAO表现出较高的个体内部变异性。

之前的研究表明，改变饮食可能会改变人类的血浆TMAO，结果好坏参半。

杂食动物体内的氧化三甲胺浓度高于素食者，因为暴露在饮食中的L-左旋肉碱会促进氧化三甲胺的产生。然而，在女性中，富含动物蛋白的4周饮食不会增加TMAO血浆浓度。然而，在一项针对健康老年男性的随机试验中，饮食中蛋白质摄入量越高，TMAO浓度越高。

另一种可以调节TMAO的饮食是RW，它富含多酚，包括白藜芦醇，被证明可以降低小鼠血浆TMAO浓度；此外，RW含有DMB，这可能是肠道微生物群的胆碱竞争对手。

然而，这项研究并没有在人类身上显示出类似的反应。同样，在有胰岛素抵抗风险的肥胖者中，摄入多酚(茶或可可黄烷醇)并不能降低空腹TMAO浓度。

我们的TMAO分析非常严格，包括一种严格的方法，几项措施，以及对个体内部变异的明确评估，证实了分析。因此，观察到的TMAO变化不太可能是由于方法问题造成的。

此外，TMAO的高个体内部变异性不太可能用药物使用、肾功能、饮食或肠道微生物群特征来解释。在此背景下，TMAO血浆浓度与毛螺菌和布劳特氏菌呈负相关(补充结果)，与TMAO形成有关的肠道细菌分类群呈负相关，而与类杆菌和罗氏菌呈正相关。这些结果与文献相反，因为拟杆菌、罗氏菌和类杆菌不能在肠道内将胆碱转化为TMA。

因此，研究了可能影响TMAO浓度的主要因素，但不能解释观测到的变化。可能需要对TMAO进行进一步的纵向评估和其他可复制的测量技术，以确定其作为单个心血管风险生物标记物的作用。例如，Wu等人发现，口服肉碱激发试验可能比空腹血浆TMAO更有效地识别产生TMAO的表型。

此外，最近的研究强调了肠道微生物群在长期情况下的个体内部变异的重要性，并揭示了肠道微生物群成员的不明影响或内在动态可能是这些变异的原因。这些被忽视的变化可以解释肠道微生物群概况或肠道微生物群依赖的代谢物（如TMAO）的差异。

此外，与戒酒后相比，对RW干预后肠道微生物群的分析显示，反刍球菌、几种类杆菌和普雷沃特氏菌占优势。在一项交叉试验中，QueipoOrtuño等人还记录了在10名健康志愿者中，摄入272ml/d 的RW持续20天后，类杆菌和普雷沃特氏菌等属的丰度增加。与Chadaideh等人的工作不同，他们发现原花青素可以诱导高脂饮食的小鼠中粘液弧菌的生长，而我们的研究中没有检测到粘液弧菌的存在，这可能是因为我们人群中的脂肪消耗量很低。

特别有趣的是，副沙门氏菌，根据判别分析法，是导致RW摄入后肠道微生物群组成发生变化的主要属。副沙门氏菌是一种被认为对纤维消化、琥珀酸生产、有益的芳香氨基酸代谢和胆汁酸代谢有益的属。与此一致的是，副藻类丰度的增加与RW摄入后血浆代谢分析中发现的一些特征有关。特别是，由于观察到IPA、龙胆酸和高香草酸浓度的增加，色氨酸和酪氨酸代谢发生了变化。

副杆菌也是变形杆菌属的一员，该菌属包括预测产生抗坏血酸盐的可以改变细胞氧化还原状态的属。与此相一致，人们注意到葡萄糖酸盐/抗坏血酸盐途径中的关键辅因子古洛酸盐的浓度有所增加。

此外，由反刍球菌、拟杆菌、普氏杆菌组成的群也是人类的核心微生物群的一部分；这一组以前被描述为一种肠型识别器，并与高分类群有关。

综上所述，肠道微生物群的这些变化表明，RW服用后发生了变化，这可能与在血浆代谢组中观察到的一些变化有关。

长期以来，RW一直被认为可以减少氧化应激。例如，先前的研究表明，RW可以减少啮齿动物结肠粘膜的氧化应激，在健康的雄性RW中，RW增加了血浆和低密度脂蛋白多酚浓度，并增强了抗氧化活性。我们的发现与RW的这些氧化还原效应是一致的。

我们发现了指示氧化还原信号调制的血浆变化，例如古洛酸、PPP中的代谢物和核黄素的组成部分核糖醇(Ribitol)的浓度增加，核黄素最近被研究证实为重要的氧化还原途径。

另一个可能对氧化还原动态平衡有利的影响是酪氨酸代谢物龙胆酸和高香草酸的浓度增加，这两种代谢产物来自具有氧化还原能力的多酚。

同时，我们注意到可能有利于胰岛素抵抗和2型糖尿病的代谢物改变，例如色氨酸代谢物IPA、吡喃葡萄糖苷、赤藓糖醇和乙基α-吡喃葡萄糖苷浓度增加，以及长链酰基肉碱浓度下降。

此外，饮用RW也可能有益地影响能量消耗和新陈代谢，如内源性大麻素浓度的降低和泛酸前体浓度的增加所表明的那样。重要的是，这些变化与中介分析(Diablo)中肠道微生物群的变化没有明显的相关性。

虽然肠道微生物群和血浆代谢组的分析可以清楚地区分本研究中的两个干预期，但我们不能确定这些变量之间存在因果关系。

这项研究有一定的局限性。RW摄入量不是通过直接样本测试来确认的，而是通过自我报告的服用量和空瓶子的返还来确认的。此外，由于我们只在短时间内调查了RW对男性的影响，我们的结果可能没有反映摄入RW的长期影响，因此可能不能推广到整个人群。相比之下，我们通过使用交叉设计将受试者之间的变异性的影响降至最低。另一个限制是，不可能确保能量代谢的变化仅仅是因为多酚或RW对肠道微生物群的影响。

酒精摄入也可能影响能量代谢，影响肝脏脂肪代谢，如脂肪酸摄取和从头合成脂肪。值得注意的是，在对RW的其他研究中经常提到的重要混杂因素，如遗传学和社会经济地位，在本设计中主要受到控制。

此外，在一项自由生活干预研究中，我们能够注意到平均而言，干预期间的饮食摄入量没有显著差异。

除了酒精摄入增加的热量外，在RW期间和戒酒期间的饮食记录中存在类似的膳食模式，这表明RW摄入是两组之间唯一的饮食差异。此外，尽管在RW干预期间能量增加了，但体重、腰围或血糖水平没有变化。

最后，与我们最初的假设相反，我们没有观察到血浆TMAO浓度下降的证据，部分原因是其个体内部的变异性。

进一步的研究需要更大的样本量、更长的持续时间和更多的重复测量来验证所报道的发现，特别是关于任何代谢物变化的假阳性发现。

综上所述，我们的发现表明TMAO测量是高度可变的，这可能会阻碍个体水平的临床随访。此外，TMAO浓度与RW摄入量没有相关性。

此外，我们的数据表明，RW干预与肠道微生物群的重塑和血浆代谢组的显著变化有关。尽管肠道微生物群的变化可能影响了摄入RW的生理效应，但这些数据仍然是假说产生的，并为未来的研究奠定了基础，未来的可能将会进行更长时间的随访和研究不同的人群。

♢ 中国人民解放军总医院第一医学中心营养科硕士

♢ 毕业于北京中医药大学，于北京协和医院实习1年

♢ 参加全国学术会议论坛并获得优秀壁报奖、优秀毕业论文

♢ 发表核心期刊文章1篇，申请专利2项

♢ 主持国家级大创课题1项，参加创新创业大赛，获奖省部级3项、校级5项

♢ 医学博士，科室副主任，主任医师，副教授

♢ 中国健康管理协会植物营养与健康分会秘书长

♢ 中国优生科学协会理事

♢ 中国营养学会临床营养分会委员

♢ 中国营养学会微量元素营养分会委员

♢ 中国营养学会首批免试注册营养师

主要研究糖、脂代谢与疾病营养。擅长围孕期及相关妊娠并发症、体重异常、围手术期及肿瘤放化疗、慢性代谢性疾病（如高血糖、血脂、高同型半胱氨酸等）及老年性痴呆等的营养治疗。

♢ 医学博士，科主任，主任医师，教授，博士生导师

♢ 中国健康管理协会临床营养与健康分会会长

♢ 中国营养学会临床营养分会副主任委员兼秘书长

♢ 中国老年医学学会营养与食品安全分会副会长

♢ 中央及全军保健会诊专家

主要研究脂代谢营养的临床应用，擅长肥胖、高脂血症、胃肠肿瘤及老年/危重症患者营养治疗，在营养风险筛查、营养评估及营养制剂/功能性食品的临床应用等方面具有丰富的经验和临床实践。