【文献速递】红酒干预不改变血浆氧化三甲胺,但与血浆代谢物和肠道微生物组成的广泛变化有关(1)

https://doi.org/10.1093/ajcn/nqac286

背景：肠道微生物组成与心血管疾病密切相关，其机制包括已报道的代谢产物（如氧化三甲胺(TMAO)）的有害影响，已被作为研究的诊断和治疗靶点。据有关报道，适量饮用红酒（RW）可以保护心脏，可能是通过影响肠道微生物组成发挥作用。

目的：采用交叉试验的多组学评价方法，研究饮用红酒（RW）对冠状动脉粥样硬化性心脏病（CAD）患者肠道微生物组成、血浆TMAO和血浆代谢组的影响。

方法：我们进行了一项随机、交叉、对照试验，研究对象为42名患有CAD的男性(平均年龄60岁)，比较服用3wk的RW(250mL/d，5d/wk)和同样时间戒酒的情况，两组先前都有2wk的洗脱期。通过16S rRNA高通量测序分析肠道微生物组成。

采用LC-MS/MS法测定血浆TMAO，采用超高效LC-MS/MS法测定随机抽取的20名受试者的血浆代谢组进行分析，采用配对检验方法进行个体比较从而评价RW摄入的影响。

结果：在RW干预和戒酒之间，血浆TMAO没有显著差异，且TMAO浓度随时间显示出较低的个体内部一致性，在控制期内组内相关系数为0.049。RW摄入后，肠道微生物组成发生了明显的重塑，β多样性和优势度发生了变化，出现了副杆菌、反刍球菌科、几种拟杆菌和普氏杆菌的差异。血浆代谢组学分析显示，服用RW后代谢物发生了显著变化，与改善的氧化还原动态平衡一致。

结论：肠道微生物群的调节可能有助于解释适度饮用红酒对心血管的好处。TMAO的个体内部一致性较低，对其作为个人层面的心血管风险生物标志物的作用提出了挑战。该研究在clinical trials.gov注册为NCT03232099。

关键词：肠道微生物组成、代谢组学、氧化三甲胺(TMAO)、冠状动脉粥样硬化性心脏病、葡萄酒、氧化还原

肠道微生物组成在心血管疾病(CVD)病理生理学的研究中，关于饮食对肠道微生物的组成、功能以及与宿主相互作用的影响的认识日益增加。

氧化三甲胺(TMAO)是一种肠道微生物依赖的代谢产物，主要是胆碱和肉毒碱，已被广泛报道与心血管疾病和主要不良心血管事件(MACEs)有关。肠道微生物组成中的不同分类群将这些膳食前体代谢成三甲胺(TMA)，三甲胺通过肝脏中的黄素单加氧酶转化为TMAO。血浆TMAO与动脉粥样硬化的负荷相关，并可独立预测心肌梗死、卒中和心血管死亡。

目前，改变血浆TMAO浓度不同的干预措施已被提出，例如与胆碱含量有关的饮食调整，通过服用益生素膳食补充剂调节以及临床干预肠道微生物组成。例如，关于使用胆碱的结构类似物3，3-二甲基-1-丁醇(DMB)和肠道微生物组成靶向抑制剂碘甲基胆碱的实验研究已被证明可非完全性地抑制TMA和TMAO的形成且降低TMAO浓度。

红酒(RW)是肠道微生物组成和血浆TMAO的一个潜在影响因素。RW被认为具有促进健康的作用，适量的RW摄入与心血管事件、癌症和总死亡率的较低发生率相关，这主要归因于其多酚成分。

葡萄酒中的主要酚类化合物是黄酮类化合物，特别是黄烷醇、黄酮醇和花青素。其他非黄酮类化合物，如羟基苯甲酸和羟基肉桂酸、酚醇和二苯乙烯，也是葡萄酒中的关键成分。多酚的化学结构、食物基质和肠-肝循环会影响多酚的生物利用度和吸收，而且很大比例的多酚不被小肠吸收。因此，∼90%的多酚原型到达结肠，进而发挥调节功能，并可能扮演类似益生菌的角色；在那里，它们作为细菌发酵的燃料，并可被大部分肠道细菌获得。

因此，RW的一些有益作用可能通过改变肠道微生物组成、粪便代谢组和血浆代谢组而发生。例如，葡萄多酚原花青素能诱导粘液阿克曼氏菌在肠道富集，该菌属与改善新陈代谢健康有关。

此外，Le Roy等在3个独立的人类队列中，报道了与RW服用相关的肠道微生物组成的α多样性增加。此外，根据一项啮齿类动物研究，RW含有DMB，一种胆碱的结构类似物，可能会抑制肠道中TMA的形成，并降低血浆TMAO浓度。在这种情况下，多酚在循环系统中的生物活性也可能取决于肠道微生物组成将其转化为生物可利用代谢物的能力，这突显了在测试给定干预措施时评估微生物组成和血浆代谢组的重要性。

然而，患有冠状动脉疾病(CAD)患者肠道微生物组成、TMAO和血浆代谢组学之间的关系仍未得到充分研究。本研究旨在评估42例男性冠心病患者短期适量饮酒对肠道微生物组成和血浆TMAO的影响，并与戒酒的男性患者进行比较。此外，还试图阐明RW对20名患者的血浆代谢组的影响。

这是一个随机、对照（1:1）的交叉试验，由两个为期3周的干预措施组成：一个涉及饮用RW，每天250mL，每周5天；另一个涉及戒酒。

每项干预之前都有2周的洗脱期，不食用任何酒精饮料、发酵食品、益生菌或益生元。该试验在www.clinicaltrials.gov 注册号NCT03232099，从2016年8月至2018年5月进行。

患者来自巴西圣保罗圣保罗大学心脏研究所（Heart Institute, University of São Paulo, São Paulo, Brazil），并从当地报纸和当地广播电台的广告中进行招募。

符合入选条件的冠心病患者年龄在46岁至69岁之间，体重指数(kg/㎡)<30，病情稳定且无症状。由于酒精代谢和TMAO代谢可能因性别不同而有所差异，所以本研究只选择男性以使样本均质化；据报道，雌性小鼠的黄素单加氧酶3(FMO3)的活性高于雄性小鼠。确诊的冠心病的定义为：至少在研究开始前30天被诊断为心肌梗死，冠状动脉造影术证明一条或多条心外膜血管≥狭窄50%，冠状动脉成形术或冠状动脉旁路移植术。重要的是，纳入的患者在方案开始前至少30天没有经历急性冠状动脉综合征(心肌肌钙蛋白T浓度<0.1μg/L)、冠状动脉成形术或冠状动脉搭桥术。

排除标准包括抗生素治疗(研究开始前<2个月)、心力衰竭(纽约心脏协会功能分级为≥II)、肾功能衰竭(根据Cockcroft–Gault公式，肌酐清除率<30mL/min)、肝功能衰竭(血小板减少、血清白蛋白降低、凝血酶原时间延长)、消化道癌、炎症性肠道疾病、梗阻性胆道疾病、既往消化手术(胆囊切除、胃切除或结肠切除)，以及糖尿病或使用降糖药。

自称经常喝RW的患者（定义为以前至少喝100mL/d的RW）不包括在研究中。患者还被要求酒精使用障碍识别测试（AUDIT）得分不超过7分。AUDIT得分用于识别有危险或有害酒精服用行为的人；得分不到7分表明酒精滥用的风险较低。

心脏研究所（Instituto do Coração-InCor-HCFMUSP）的科学委员会和圣保罗大学医学院附属医院的机构伦理委员会批准了该研究方案（SDC 4257/15/084-CAAE 57379216.0.0000.0068）。所有患者在参与研究前都给予了书面知情同意。

对于样本量的计算，我们假设在RW干预后，TMAO浓度将下降1.0μM，并且患者内的标准偏差为1.5%。这些假设是根据Tang 等人的研究做出的。

我们假设I类错误为P<0.05，测试功率为80%，估计将需要38名患者。因此，考虑到干预期间10%的脱失率，发现应该包括42名患者；使用样本量计算器进行计算。

患者被随机分配开始服用RW的3wk干预或戒酒的3wk干预。

在各自的干预期开始时，为所有患者提供Ibravin(巴西葡萄酒协会)生产和供应用梅洛葡萄品种酿造的RW。EmbRapa(巴西农业研究公司)对葡萄酒的质量进行了评估，并在获得技术批准后将其放行供服用。

使用的葡萄酒是为本研究定制的2014年的Merlot，于2016年8月装在250mL的瓶子里。之所以选择Merlot品种，是因为它是最适合巴西南里奥格兰德州土壤和气候的葡萄之一，样品就是在那里定制的。之所以选择250mL的RW剂量和24g的∼酒精，是因为这一剂量的RW已被证明与有益效果有关，并已被用于先前几项关于RW对肠道微生物组成影响的研究。对于男性来说，适度饮酒可以定义为每天摄入1-3杯标准饮料或相当于10-30g酒精。

RW样品的酒精含量（v%）为12.75，总酸度（mEq/L）为95.58，挥发性酸度（mEq/L）为7.44。它含有109mg/L的总花青素（DescSO2）和2155mg/L的儿茶素总多酚。

患者收到21个贴有标签的瓶子和书面指导，要求他们每天喝250mL，每周5d，持续3wk。他们还得到了一份饮食记录表，记录每天的葡萄酒服用量。在RW干预期结束后，患者归还了21个RW空瓶并完成了饮食日记。

在获得书面知情同意后，进行随机化分组，患者回访5次，包括临床和营养评估、人体测量和样本采集。在第一次就诊时，没有样本采集，由一名训练有素的护士或医生访视患者；记录他们的生命体征、体重、身高和腰围；并在随后的四次回访前1天在家中进行粪便样本采集。

此外，在第一次就诊期间，患者接受了专业营养师进行的营养评估，他们提供完成3d饮食记录的说明，并建议患者保持平时的饮食和体力活动等指导。

患者还收到关于2周洗脱期的书面和口头指示，在此期间，他们被指示需要避免摄入任何酒精饮料、发酵产品、益生菌或益生元。经过2个洗脱期和2个干预期后，进行了4次医院回访，在此期间进行了血样采集、临床访谈和营养评估。研究设计的示意图如图1所示。

（图1）

每次回访前1天，患者都会带回家中采集的粪便样本。主要目的是评估RW饮酒组和戒酒组之间肠道微生物组成和血浆TMAO浓度的变化。

对于生化分析、TMAO分析、微生物组成分析和代谢组学分析，收集结果数据的评估者和数据分析员对指定的干预措施是双盲的。

专业的营养师在每次回访时都会进行面谈，重点是完成饮食日记和遵守饮食指南，即在整个研究过程中避免其他富含多酚的食物、所提供的RW以外的任何酒精饮料、益生菌、益生元和发酵产品，并保持类似的饮食模式。

在这方面，有书面指示要避免食用啤酒、葡萄或葡萄汁、浆果或浆果汁、酸奶、康普茶、开菲尔酸菜或其他发酵蔬菜，以及任何添加纤维或合成益生菌的产品，如菊粉、低聚果糖或纤维乳制品。

患者还被告知，如果他们对这些产品的服用有任何疑问，可以打电话或给营养师发电子邮件。这些措施旨在减少RW以外的习惯饮食变化对肠道微生物组成的干扰。

患者被要求在两次干预结束后3天(2个工作日和1个周末)记录他们在过去24小时内的食物消耗量包括所有消耗的食物和饮料，用以完成3d饮食记录。

膳食评估由人工记录，回来后进行营养学评估。总能量、宏量营养素和微量营养素的每日摄入量是根据巴西食品成分表-TACO和第二版巴西食物成分表确定的。

定期对患者进行安全性评估，除了去医院回访外，还鼓励患者通过电话或电子邮件联系研究人员，如果他们遇到任何与干预措施有关的不良健康影响，例如在RW不耐受的情况（有限的头痛、头晕、胃肠道不适，或其他形式的不耐受），患者将被排除在外。

如果有任何并发症，例如心肌梗塞、中风、心脏或消化道手术，或者抗生素或抗糖尿病药物的使用，该方案就会中止。

患者收到了关于收集粪便样本的口头和书面指示。他们被建议在回访前1天或回访当天使用带有DNA稳定缓冲液的采集管(Stra TEC Biomedical AG)采集样本。

样本即刻储存在提供环境为4°C的冷却器中，然后被运送到医院，在那里它们立即被冷冻到-20°C的环境下进行分析。

用PSP Spin Spool Plus DNA试剂盒(Stra TEC Biomedical AG)从200 mg粪便中提取肠道微生物的总DNA。根据Illumina 16S元基因组文库制备指南，扩增细菌16S rRNA基因高变区(V3-V4)，序列为338F-5´-TCGT CGGC AGCG TCAG A TGT GTA T AAGA GACA GCCT ACGG GNGG CWGC AG-3´和785R-5´-GTCT CGTG GGCT CGGA TG TGTA TAAG AGAC AGGA CTAC HVGG GTA T CTAA TCC-3´(2×300bp的双端阅读片段，插入大小为∼550bp)。

根据Magro等人的说法，DADA2工具用于分析FASTQ序列，以从扩增子数据中恢复单核苷酸分辨扩增序列变体(ASV)，ASV总数为1,106。删除位于5´处的接头序列结束时，trimLeft选项设置为17和21(分别为正向和反向读取)。

数据经过了预处理，去除了可能的污染物(线粒体和叶绿体序列)，并过滤了不常见的特征(读取计数<10的特征，存在于<2个样本中)。

分类分配是使用DADA2中实施的朴素Bayesian分类器方法执行的，使用SILVA数据库作为参考(132版)。用丰富度、辛普森指数和香农指数评价α多样性，用稀疏偏最小二乘回归-判别分析评价β多样性。所有肠道微生物组成数据通过配对分析进行比较。

使用cOmponents（DIABLO）R软件包6.3.2版进行数据整合分析，用于评估和整合这2个数据集。DIABLO是一种多组学整合方法，通过选择分子的特征子集，寻求不同数据类型的相关信息，同时在多个表型组之间进行判别。

它在识别关键的全向性变量的同时，最大限度地利用多个全向性（多组学）数据集之间的共同或相关信息。DIABLO是一种基于组件的方法（或降维技术），它将每个数据集转化为组件，使组件和感兴趣的表型之间的相关性最大化。DIABLO分析的第一步涉及选择成分的数量。正确的成分数可以通过评估所有指定成分数的模型性能来评估。

这项分析的目的是同时识别相关和区分微生物区系和血浆代谢组学的特征，能够在患者队列中区分RW和酒精戒断干预。

我们跨5个组件对该模型进行了评估。使用Perf函数执行评估，将交叉验证方法设置为Leave-One-Out(验证=“loo”)。在此过程中，使用不同的预测距离(最大距离、质心距离或马氏距离)将每个新的观测值分配给最终的预测类别。性能图(补充图2)显示，错误率从1个分量降低到2个分量。

在我们的数据集中，我们发现Mahalanobis距离（一种衡量点和分布之间距离的多变量距离指标）产生了最好的准确性，表明最佳组件数量是2。

下一步是使用tune.block.splsda函数调整每个数据集和每个组件选择的特征数量（keepX参数）。在可能的keepX变量的网格中选择最佳的变量数（从最小的5个到最大的30个特征）。对于每一个keepX变量的数量，该函数使用留一交叉验证法评估模型对2个组的判别性能。该模型为第一部分识别了6个分类群，为第二部分识别了5个分类群，以及为第一部分识别了9个代谢物，为第二部分识别了5个代谢物。这些选定的特征被认为是能更好区分RW和戒酒干预的多组学生物标志物的代表。

在治疗过程中，经过12小时的通宵禁食，所有42名患者在4次检查中的每一次都采集了血液样本。

采集后，将血样保存在冰箱中，分离成血清和血浆，放置在Eppendorf 管中，立即保存在-80℃的环境下进行分析。所有血样分析只分两批进行，以确保低变异性的发生。

为了评估TMAO的个体内部变异性，我们在方案结束后随机选择了10名患者进行了4次额外的访问（每周两次）。在禁食12小时后，收集血样并通过3种技术进行分析。我们建议患者不要改变药物、饮食或运动。

对变异性的评估采用了3种不同的采集技术：

1）采集血样，分离成血清和血浆，放在Eppendorf管中，采集后立即冷冻在-80℃；

2）采集血样，分离成血清和血浆，放在Eppendorf管中，采集后冷藏2小时，然后冷冻在-80℃；或者

3）用指尖的血样进行干血点（DBS）分析。

按照Wang等所使用的方法，用200μL甲醇(10μM含有内标TMAO-D9)从50μL血浆样品中提取TMAO，机械搅拌(涡流)后变性蛋白质。

血浆样品经离心沉淀蛋白质，取一份上清液注入LC-MS/MS系统。在含有0.7%氯化钠(w/w)的5%牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)水溶液中加入TMAO (μM)，得到分析曲线(0.2 5~2 0 0μM TMAO)和对照样品(0.5、5和100μM TMAO)。TMAO和TMAO分析标准购自Sigma-Aldrich。

DBS样本取自Whatman Paper 903(Protein Saver Card；GE Healthcare)上采集的2滴全血，经指尖刺伤后获得。DBS卡片在室温下干燥1h，为了从DBS样品中提取TMAO，从DBS卡片上取两个3.0 mm的圆形“冲头”，放置在1.5mL Eppendorf试管中，加入含有1.0μM内标TMAO-D9的150μL 75%甲醇/25%水(v/v)溶液。将试管与旋涡混合10s，超声3min，旋流10s，在4◦C下10,000×g离心3min。将1/4的萃取液转移到96孔板(或小瓶)并进样到LC-MS/MS系统中。在不加TMAO的全血中加入TMAO(μM)，制备分析曲线(0.2 5~2 0 0μM TMAO)和对照样品(0.5、5和10 0μMTMAO)。在TMAO提取程序之后，在卡片上采集血液，然后进行分析。

为了定量提取的血浆和DBS样品中的TMAO及其内标TMAO-D9，使用了液相色谱仪(Agilent 1260；Agilent Technologies)和混合三重四极线型离子陷阱质谱仪(3200QTRAP；SCIEX)。

在LC系统中，使用Atlantis HILIC硅胶柱(100×3.0 mm，3μm；Waters Corp)，保持在35◦C，并采用以下流动相：(A)含有10 mm甲酸铵的水溶液(LC-MS级；Sigma-Aldrich)和(B)含有10 mm甲酸铵的90%乙腈/10%水(v/v)溶液。

进样体积为10-μL，洗脱条件为：0~1min，0%流动相(A)；1.0~5.20min，90%(A)~10%(B)；5.20~7.50min，保持90%(A)；7.50~11.5min，回到初始0%状态(将流速增加至600min/μ)，并在重新进样前额外平衡1.0min。TMAO/TMAO-D9保留时间为6.15min。

分离后，化合物被电喷雾离子化（Turbo V; SCIEX）源在5200V的正模式下，雾化器气体在45psi，加热器气体在50psi，帘子气体在15psi，在MS/MS系统中通过多重反应模式优化分析以下m/z转换。76（前体离子）>58（产物离子）和85>66，分别为TMAO和TMAO-d9。

使用随机整数发生器（random.org），42名患者中的20名被随机分配到他们的血浆代谢组分析中。该次分析的样本量是用MetSizeR程序确定的。

从4次回访收集的血样中，选择20名患者和80个样本进行非靶向血浆代谢组分析。

样品储存在-80◦C，用Metabolon公司进行的超高效液相色谱-质谱/质谱（Waters ACQUITY）与HESI-II Thermo Scientific Q-Exactive Orbitrap（35,000质量分辨率）进行无目标评价。简要的方法细节在补充方法中提供。

42名患者的血样是在禁食12小时后的所有4个回访日收集的。血样分析是在采集当天进行的。每次回访时，我们都会分析空腹时的血浆葡萄糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、血清白蛋白。

血清胆红素、血清乳酸脱氢酶、γ-谷氨酰转移酶、凝血酶原时间、高敏C反应蛋白、IL-6、全血计数、肌酸、尿素和血清脂多糖。这些测试是在Dimension EXL分析仪（西门子医疗）上进行的，但肌钙蛋白I除外，它是用化学发光免疫测定法（ADVIA Centaur-XP; TnI-Ultra; Siemens Healthineers）进行的。

总血红蛋白、白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和其他免疫细胞（包括单核细胞、肥大细胞、嗜碱性细胞和嗜酸性细胞）的血液计数是使用Sysmex XN-2000自动血液分析仪（Sysmex America）获得的。

肌酐清除率是用Cockcroft-Gault方程估计的，Friedewald方程被用来估计低密度脂蛋白胆固醇。

使用Windows(SPSS，Inc.)SPSS v.25软件执行所有统计分析。或R(R版本4.0.3；R统计计算项目)。根据变量的类型(定性或定量)，通过描述性措施对变量进行评估。对于定性变量，计算了频率和百分比。

正态分布通过Shapiro-Wilk检验进行评估。将服从正态分布的数据与双侧配对t检验进行比较。不服从正态分布的数据使用配对的Wilcoxon检验进行比较。

检验所有假设所采用的显著性水平为5%。使用Spearman等级相关试验计算TMAO测量值与尿素、肌酐、肾小球滤过率、血脂测量值、宏观营养素和微量营养素之间的相关性。广义估计方程法被用来评估不同干预组（RW和戒酒）中个体内TMAO测量的模式，以及与使用血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂、血管紧张素受体阻断剂和利尿剂的关系。这验证了时间的影响，有一个独立的利益变量来评估一段时间的措施。

我们想观察组与组之间、时间与时间之间以及变量与时间之间的交互作用是否存在差异。使用Bonferroni检验进行配对比较。我们通过重复测量分析和类内相关系数（ICC）调查了血浆TMAO的个体内部一致性。

（第一期完）

♢ 中国人民解放军总医院第一医学中心营养科硕士

♢ 毕业于北京中医药大学，于北京协和医院实习1年

♢ 参加全国学术会议论坛并获得优秀壁报奖、优秀毕业论文

♢ 发表核心期刊文章1篇，申请专利2项

♢ 主持国家级大创课题1项，参加创新创业大赛，获奖省部级3项、校级5项

♢ 医学博士，科室副主任，主任医师，副教授

♢ 中国健康管理协会植物营养与健康分会秘书长

♢ 中国优生科学协会理事

♢ 中国营养学会临床营养分会委员

♢ 中国营养学会微量元素营养分会委员

♢ 中国营养学会首批免试注册营养师

主要研究糖、脂代谢与疾病营养。擅长围孕期及相关妊娠并发症、体重异常、围手术期及肿瘤放化疗、慢性代谢性疾病（如高血糖、血脂、高同型半胱氨酸等）及老年性痴呆等的营养治疗。

♢ 医学博士，科主任，主任医师，教授，博士生导师

♢ 中国健康管理协会临床营养与健康分会会长

♢ 中国营养学会临床营养分会副主任委员兼秘书长

♢ 中国老年医学学会营养与食品安全分会副会长

♢ 中央及全军保健会诊专家

主要研究脂代谢营养的临床应用，擅长肥胖、高脂血症、胃肠肿瘤及老年/危重症患者营养治疗，在营养风险筛查、营养评估及营养制剂/功能性食品的临床应用等方面具有丰富的经验和临床实践。