文献解读 666 FOOD CHEM:葡萄酒中新型(+)-儿茶素-咖啡酸加合物的鉴定和结构表征

葡萄酒中新型(+)-儿茶素-咖啡酸加合物的鉴定和结构表征

期刊：Food Chemistry（8.8）

发表日期：2024.02

在瓶装30个月的白葡萄酒中发现了一种负离子模式下分子离子质量为m/z 467的新化合物。在后者中，观察到与羧酸（-44 a.m.u.）、咖啡酸单元（-178 a.m.u.）和Retro-Diels Alder（-152 a.m.u.）的损失相容的碎片离子。本工作报道了由咖啡酸和(+)-儿茶素之间的缩合反应产生的(+)-儿茶素-咖啡酸加合物的合成。核磁共振的结构表征表明，该加合物是由(+)-儿茶素A环处的C8与咖啡酸的C9之间的连接形成的。此外，合成化合物的HPLC保留时间和紫外-可见光谱与在白葡萄酒和装瓶实验中检测到的化合物相似，证实了这些基质中存在这种新型(+)-儿茶素衍生化合物。

葡萄酒的酚类成分取决于所使用的葡萄以及酿酒过程。在酿造和储存过程中，会发生氧化/还原反应、缔合或络合反应等，进而影响葡萄酒的颜色、涩味和苦味。

还描述了葡萄酒成分与橡木或软木塞中的小分子之间的相互作用。单宁、酚酸和醛会参与与某些葡萄酒成分的聚合反应，形成了陈年葡萄酒中的复杂结构。

本研究的目的是首次通过NMR和LC/MS对(+)-儿茶素和咖啡酸相互作用产生的新化合物进行结构表征。

1. 白葡萄酒样品

2. 装瓶研究

3. 高压液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD）分析

4. 液相色谱-电喷雾电离-质谱（LC-ESI-MS）分析

5. (+)-儿茶素-咖啡酸加合物的合成

6. (+)-儿茶素-咖啡酸加合物的制备型HPLC

7. 核磁共振（NMR）

研究了白葡萄酒（30个月）中新酚类化合物的存在。为此，在乙酸乙酯液-液萃取后获得两种馏分（有机和水）。通过HPLC-DAD和LC-MS在负离子模式下分析馏分，并鉴定出已知多酚化合物的不同家族。

此外，有可能在负离子模式下鉴定出微量的新化合物，其离子质量为m/z 467，与先前装瓶研究中发现的特征相同。这项装瓶研究是为了了解从软木塞迁移的化合物如何影响与葡萄酒成分的相互作用。

储存15个月后，通过LC-MS可以检测到与没食子酸（[M−H] m/z 169）和蓖麻苷（[M−H] m/z 933）、香兰素（[M−H] m/z 151）等（图1A）。

图1. （A）从装有(+)-儿茶素的瓶子中在15个月和24个月后鉴定出从软木塞迁移到葡萄酒模型溶液的化合物，280 nm处的HPLC色谱图；（B）儿茶素-咖啡加合物（m/z 467）的负模式ESI质谱和MS2谱

24个月后，在[M−H] m/z 467处检测到新的色谱峰，表明它应该是由(+)-儿茶素和软木成分之间的反应产生的。然而，在这段时间结束时，从软木中提取的酚类化合物实际上不存在于溶液中，这可能是由于发生的缩合和聚合反应。

这种新形成的化合物在这些反应中被检测和鉴定为[M−H]-M/z 467, MS2光谱的破碎模式与-44单位（羧酸），-178单位（咖啡酸），-152单位（Retro Diels Alder，儿茶素的特征）的损失相一致。分子质量和碎片模式（图1B）与儿茶素-咖啡酸加合物相容。

为了确认这种新化合物的结构和形成机制，将前体咖啡酸（1 g/L）和(+)-儿茶素（1 g/L）在pH 3.2、35℃的12%乙醇水溶液中孵育，每天进行HPLC-DAD监测。4个月后形成了新的色谱峰，保留时间、分子量和碎裂模式相同，但含量较低。为了提高反应收率，在不同的pH值下进行了几次反应。当pH值从3.2增加到6.5时，形成量最大，并且在10天内实现了最大的产物形成量（图2）。

图2. HPLC色谱图，在280nm处，在咖啡酸和(+)-儿茶素37°C和pH 6.5之间的反应10天结束时

由于儿茶素可以在C6或C8中形成键，因此可以形成不同的异构体从而获得了分子离子质量为[M−H] m/z 467的多个峰。制备型高效液相色谱法分离了形成量较大的异构体，并通过质谱、1D和2D-NMR实验完全确定其结构（表1）。

表1. 质子化学位移（δ1H）、耦合常数（J, Hz）和碳化学位移（δ13C）为(+)-儿茶素-咖啡酸在氘代甲醇中的加合物

观察到该化合物的化学转变（1H和13C）见表1。核磁共振数据显示，与之前描述的咖啡酸和儿茶素的信号相似。芳香族单线态的浓度为6.08 ppm（H6A）和其他三个芳香质子在6.63、6.67和6.58 ppm（分别为H-2′B、H-5′B和H-6′B）共振。此外，观察到四个脂肪族质子（H-4Cα和H-4Cβ，H-3C，H-2C）相互偶联，证实了儿茶素单元的存在。

在咖啡酸的情况下，两个特征双峰在6.15和7.58 ppm处相互耦合，对应于H-2和H-3，两个单重态信号对应于H-5D（7.17 ppm）和H-8D（6.64 ppm）。

事实上，这种键似乎发生在D环（咖啡酸）的C9处。在NOESY光谱中，可以观察到咖啡酸的H8D质子与(+)-儿茶素的H2B质子之间的相关性（图3），表明两个质子在空间上接近，这证实了加合物的连接是在(+)-儿茶素的A环的C8位置形成的，而不是在C6位置。

图3. 用MeOD-d4记录的儿茶素-咖啡酸加合物的1H NMR谱

表1描述了HSQC和HMBC中发现的所有相关性，并且与所提出的结构一致（图3）。例如，HSQC光谱可以识别与质子直接相连的碳：C2C的、C3C的、C4C的、C6A、C2′B、C5′B、C6′B、C2、C3、C5D模型、C8D（8D）。考虑到从LC/MS以及一维和二维NMR实验中获得的所有数据，儿茶素-咖啡酸加合物的化学结构可以明确地识别出来，如图3所示，儿茶素的C8与咖啡酸的C9之间有一个单键。儿茶素-咖啡酸加合物的形成机制如图4所示。

图4. 提出了形成新化合物的机理

所提出的机制是由(+)-儿茶素环的C6/C8对来自吸电子羧基的咖啡酸的正电C9的亲核攻击引起的。最终的C-C键形成包括氧化步骤，产生新的儿茶素-咖啡酸加合物。

成功鉴定了一种新的儿茶素-咖啡酸加合物。这种新化合物的完整结构表征和在模型溶液中进行的研究表明，它是由咖啡酸和(+)-儿茶素之间的相互作用引起的。在装瓶实验中，咖啡酸被确定为一种从软木塞迁移而来的化合物，但在葡萄酒的情况下，已知咖啡酸是一种已经存在于葡萄中的化合物，这就是为什么这种新化合物可能具有更大的重要性。此外，由于葡萄酒是一种复杂的基质，可能存在其他化学形成方式，仍然需要发现新的方法。

Grape Research

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