酿酒酵母表面原位合成β-环糊精辅助外流和高产β-香树脂醇
作者：本站编辑
2023-01-11 06:42:52
73
DOI：10.1002/bit.28327
杂志：Biotechnology and Bioengineering
作为多种植物五环三萜生物合成的关键中间体，β-香树脂醇因其抗氧化活性在食品与医药行业中有着广泛应用。目前，β-香树脂醇已经实现了在酿酒酵母中的异源合成。然而，该化合物是使用重组酿酒酵母以较低的克数在细胞内产生，这限制了工业应用。细胞内积累被认为是达到更高滴度和简化提取过程所面临的关键挑战。为解决此问题，作者在先前的实验中使用了两亲性β-环糊精(β-CD)辅助β-香树脂醇的流出。然而，培养基中补充的β-CD与β-香树脂醇的合成不一致，并且具有成本较高的缺点。因此，本研究开发了一种基于β-CD 原位合成的辅助外排系统，以增强β-香树脂醇的生物合成及其外排。结果合成的 β-CD 可以捕获16%的细胞内β-香树脂醇，并将总产量提高77%。此外，还采用了包括诱导系统重塑、前体供应增强、两相发酵和脂质合成调节等策略，使得摇瓶中β-香树脂醇的产量增加到73 mg/L，比原菌株高31倍。总的来说，这项工作为工程酿酒酵母中具有高疏水性的天然产物的辅助流出提供了新的策略。1.酿酒酵母表面β-环糊精(β-CD)原位合成的设计
为了实现酿酒酵母表面β-环糊精(β-CD)的原位合成，作者选用了含有表面展示的Aga1p-Aga2p锚对的商业酿酒酵母菌株EBY100作为平台。其中，Aga1p可以通过β-1,6-葡聚糖键瞄定到细胞壁上，而Aga2p则可以通过两个二硫键与Aga1p组装并与目标蛋白融合，从而实现目标蛋白的表面展示。基于此，作者构建了重组质粒pYD1-FLAG-cgt并将其导入EBY100菌株，以便将CGT编码的目标蛋白CGTase（催化可溶性淀粉生成β-CD）融合到Aga2p的C末端，并将FLAG标签插入到CGTase的N末端用于免疫荧光测定。值得注意的是，Aga1p与融合蛋白Aga2p-CGT均在半乳糖诱导启动子Gal1控制下表达。结果显示，在最佳诱导条件20°C下由半乳糖诱导后，Aga1p和Aga2p-CGT表达并分泌出来，其中，Aga1p锚定在细胞壁上，并通过两个二硫键与Aga2p-CGT特异性组装。免疫荧光测定中也成功在工程菌株的表面观察到清晰的绿色荧光，证实了上述结论。由于β-CD不仅捕获β-香树脂醇，还捕获酵母细胞中的角鲨烯和其他脂质，β-CD被进一步设计为在培养的后期产生。如图所示，当诱导后培养时间为36 h时，仅在培养基中上清液中产生高浓度β-CD，当培养时间超过60 h时，则未能检测到β-CD；而细胞表面展示产生的β-CD则在培养36至60小时内逐渐增加，这可能是由于分泌的CGTase逐渐锚定。这一现象表明，与分泌型酶相比，表面展示的CGTase可以在更长的培养时间内持续产生β-CD。此外，随着诱导温度从20℃增加到30℃，β-CD的产量明显下降，说明较高的温度不利于CGTase的分泌和表面展示。为了判断原位合成β-CD捕获细胞内β-香树脂醇是否可行，作者在上述工程菌株EBY100-CGT中表达了来自光果甘草的β-香树脂醇合酶bAS，以实现酵母中β-香树脂醇的异源合成。基于此，在摇瓶发酵过程中，将淀粉加入到培养基中用于β-CD合成，并通过在工程菌株EBY100-bAS-CGT、EBY100-CGT和EBY100-bAS（对照）中分别添加半乳糖来诱导表面展示系统。发酵72小时后，提取产物并进行GC-MS检测。结果显示，成功在EBY100-bAS-CGT中检测到了β-香树脂醇的产生，产量达到4 mg/L，比对照菌株高77%，且胞外β-香树脂醇占总产量的16%；而对照菌株中则未检测到细胞外β-香树脂醇。同时，β-CD只能在EBY100-bAS-CGT的培养基上清液中检测到，产量为14 mg/mL，对照中则未能检出。这些结果表明，表面展示系统合成的β-CD确实有助于β-香树脂醇的流出，同时促进细胞内的产生。然而，β-CD的包涵能力是非特异性的，需要更多的策略来减少其他化合物对β-CD的竞争。3.优化β-CD合成以提高β-香树脂醇的辅助流出和生产
为了简化发酵过程，作者引入了基于Gal4的温度敏感突变体Gal4M9（GAL1/2/7/10 启动子的激活剂），从而将天然半乳糖诱导系统重建为温度诱导系统。具体而言，Gal4表达盒在组成型启动子ACT1控制下被Gal4M9取代，随后将PGAL驱动的GgbAS和AGA2-CGT表达盒分别整合到酵母染色体的GAL4和GAL80位点，得到菌株EBY102-120。选择24℃作为诱导温度，诱导CGTases的表达、分泌和表面展示。如图所示，CGTases在24°C诱导下显示在所得菌株表面。此外，观察到对β-香树脂醇的细胞内合成有明显的拉动作用。同时，与菌株EBY100-bAS-CGT相比，菌株EBY102-120的生物量增加了50%。为了进一步提高β-香树脂醇的产量，异源基因ERG1（来自白色念珠菌）和内源性tHMG1、ERG20、ERG9被组成型强启动子在菌株EBY102-120的多拷贝NTS位点过表达，得到菌株EBY102-124。用淀粉培养后，β-香树脂醇总产量增加到 46 mg/L，比EBY102-120高6倍；且细胞外检测到 4 mg/L β-香树脂醇，这是对照、不用淀粉培养的EBY102-124的10倍。此外，细胞合成和额外添加β-CD的辅助流出效果无明显差异，表明由表面展示的CGT酶原位合成的β-CD与外源添加的β-CD发挥了相似的作用。为了在发酵过程中回收β-CD以更好地运输，作者采用了双相发酵，选择疏水性溶剂肉豆蔻酸异丙酯（IPM）作为萃取剂，以迅速从β-香树脂醇-β-CD复合物中提取β-香树脂醇，从而使β-CD为空，以进行下一个辅助流出过程。当通过改变温度至24°C诱导EBY102-124时，IPM与可溶性淀粉一起添加到培养液中。培养结果显示，IPM对细胞生长和CGTase的表面显示没有显著影响。此时，EBY102-124的胞外β-香树脂醇含量高达11mg/L，是对照菌株的28倍，而β-香树脂醇的总产量则增加到了54mg/L，比对照菌株增加了20%。为了进一步验证IPM对基于β-CD的β-香树脂醇辅助外排功能，作者将EBY102-124在添加和不添加淀粉的IPM培养基中培养。如图所示，细胞外产量仅为2mg/L，这表明IPM可以单独从细胞中提取少量β-香树脂醇，但提取不足。该结果证实了β-CD和IPM的协同作用，尤其是β-CD的循环过程，可以改善β-香树脂醇的辅助外排。因此，β-CD可以被认为是酵母细胞和IPM之间的重要运输工具。据报道，β-CD在包封过程中影响膜的渗透性和流动性，尤其是含有不饱和脂质的膜。因此，可以改变膜组成以调节β-CD介导的β-香树脂醇的流出。考虑到上述报道的结果，菌株EBY102-124的膜含量通过过表达DGK1和OLE1以及敲除DGA1得到改善。所构建的菌株EBY102-140中β-香树脂醇的胞内产量没有显著差异，而胞外产量显著增加至31 mg/L，导致总产量为73 mg/L。细胞外比率增加到42%，比EBY102-124高2倍。作者推测，DGA1的破坏和DGK1的过度表达可能会将DAG池拉向PA合成，而OLE1的过度表达会增加脂肪酸的不饱和度，从而导致β-香树脂醇的辅助外排增强。实验证明，膜脂质的不饱和百分比没有显著变化，而中性脂质的不饱和度增加，证实了PA合成的调节影响了β-香树脂醇的产生，并增强了β-CD-IPM辅助的β-香树脂醇在酿酒酵母中的流出。
在这项研究中，作者设计了一种生产β-CD的原位合成策略，以辅助β-香树脂醇的流出。还采用了包括诱导系统重塑、前体供应增强、两相发酵和脂质合成调节等策略，促进了β-香树脂醇的胞外产生。这些策略可为高疏水性产物的生物合成和辅助流出提供参考。
李文娟 摘译
